腦脊液細(xì)胞學(xué)的診斷方法及要點(diǎn)
-文章轉(zhuǎn)載：華山腦脊液檢驗(yàn)之窗 原創(chuàng)： 王迪
國(guó)內(nèi)腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查目前存在的主要問題有：1.部分臨床醫(yī)生對(duì)腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查的重要性認(rèn)識(shí)不足，2.缺乏標(biāo)準(zhǔn)制片流程（由于腦脊液細(xì)胞數(shù)較低，普通制片流程往往檢出率很低，標(biāo)準(zhǔn)制片流程對(duì)提高檢出率至關(guān)重要），3.從事細(xì)胞學(xué)檢查的有經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)或病理醫(yī)師嚴(yán)重不足。然而以下情況還是有必要進(jìn)行腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查：1）腦脊液細(xì)胞計(jì)數(shù)增多；2）CT陰性的疑似蛛網(wǎng)膜下腔出血；3）排查腫瘤性腦膜炎；4）MRI提示腦膜強(qiáng)化。腦脊液細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查作為快速、有效及低成本的方法，已經(jīng)成為我院的特色檢查項(xiàng)目，是神經(jīng)系統(tǒng)疾病的篩查與診斷工具。在這里，我們提供了一份從腦脊液樣本處理到CSF細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞學(xué)分類、細(xì)胞學(xué)診斷的實(shí)踐總結(jié)給廣大同仁參考交流。為了解腦脊液檢查現(xiàn)狀，文末我們還提供了一份腦脊液檢查現(xiàn)狀的小調(diào)查，懇請(qǐng)各位同仁撥冗填寫，并歡迎多提寶貴建議！
概述
腦脊液（CerebroSpinal Fluid, CSF）細(xì)胞學(xué)，是神經(jīng)病學(xué)家的最重要工具之一，包含總體細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞學(xué)分類，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)及其涵蓋的一系列病理狀況提供重要的第一手信息。CSF樣本需要立即處理，盡可能在收集后1小時(shí)內(nèi)處理。離心制片后，我們實(shí)驗(yàn)室通常采用瑞氏染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查。對(duì)于細(xì)胞背景提示有感染存在時(shí)，我們會(huì)加做抗酸染色、革蘭染色等，并尋找相關(guān)病原體。發(fā)現(xiàn)異形細(xì)胞時(shí)，我們常通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色來進(jìn)一步確定并鑒定腫瘤細(xì)胞。在正常CSF細(xì)胞以T淋巴細(xì)胞為主，少量單核巨噬細(xì)胞，偶見B淋巴細(xì)胞。細(xì)胞數(shù)明顯增加，鏡下以中性粒細(xì)胞為主時(shí)多見于細(xì)菌性腦膜炎，需進(jìn)一步尋找胞內(nèi)細(xì)菌證據(jù)。以淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞為主的細(xì)胞背景多見于病毒感染和慢性炎癥。以混雜細(xì)胞反應(yīng)為背景時(shí)，可發(fā)生于結(jié)核性腦膜炎。吞噬紅細(xì)胞或含血紅蛋白降解產(chǎn)物片段的巨噬細(xì)胞（后者稱為含鐵血黃素細(xì)胞），均提示陳舊性的蛛網(wǎng)膜下腔出血。鏡下發(fā)現(xiàn)異型細(xì)胞懷疑腫瘤時(shí)，需結(jié)合臨床及免疫細(xì)胞化學(xué)染色綜合判斷。
處理時(shí)間
由于腦脊液樣本在體外2小時(shí)后細(xì)胞快速裂解。與腦脊液生化分析不同，CSF細(xì)胞學(xué)和細(xì)胞計(jì)數(shù)檢查需要立即處理新鮮液體，最好在腰椎穿刺后1小時(shí)內(nèi)。按照我們實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)，腦脊液采集后在4攝氏度下保存條件下存放4小時(shí)，細(xì)胞形態(tài)基本可保持完整。
外觀檢查
新鮮CSF的肉眼檢查可提供重要的第一手信息，應(yīng)作為CSF檢驗(yàn)報(bào)告的一部分。正常腦脊液清澈無色。如果白細(xì)胞計(jì)數(shù)高于1,000/μL，腦脊液顏色可呈現(xiàn)混濁和不透明。化膿性炎癥通常呈現(xiàn)出濃稠和黃色至綠色。明顯呈現(xiàn)的紅色提示腦脊液樣本可能發(fā)生了血液污染。連續(xù)數(shù)管的樣本收集，可以幫助區(qū)分腰穿刺術(shù)本身相關(guān)的創(chuàng)傷性血液污染或真正的蛛網(wǎng)膜下腔出血：如果連續(xù)的CSF樣本逐漸變清提示可能是進(jìn)針時(shí)傷及血管所致，而持續(xù)性變色則表明真正的蛛網(wǎng)膜下腔出血。黃變癥（Xanthochromia）即黃色變色，在離心后持續(xù)存在，它是由膽紅素水平升高引起的。值得注意的是，創(chuàng)傷性血液污染可導(dǎo)致CSF細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，CSF混入外周血時(shí)，CSF細(xì)胞學(xué)可出現(xiàn)明顯的偏差。我們?cè)龅竭^腰椎穿刺被骨髓細(xì)胞污染的腦脊液標(biāo)本。因此腦脊液細(xì)胞學(xué)標(biāo)本最好是穿刺后的第二管沒有血液混入的樣本。
細(xì)胞計(jì)數(shù)
使用牛鮑氏（Neubauer）計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。正常細(xì)胞計(jì)數(shù)范圍為白細(xì)胞每微升0至4個(gè)（mm^3）。高于5/μL 的細(xì)胞計(jì)數(shù)被稱為白細(xì)胞異常升高或細(xì)胞增多癥。未成熟的血腦屏障細(xì)胞滲透性較高，在足月新生兒腦脊液中常見細(xì)胞數(shù)高達(dá)10/ μL。在早產(chǎn)兒中水平甚至可以達(dá)到30 / μL。然而，在產(chǎn)后第六周，細(xì)胞計(jì)數(shù)逐漸下降并且任何持續(xù)升高的細(xì)胞計(jì)數(shù)被認(rèn)為病理性升高。按升高的程度可分為輕度（5-50/ μL），中度（50-150 / μL）或嚴(yán)重（150-3,000 / μL）。下表總結(jié)了典型的細(xì)胞計(jì)數(shù)及其相關(guān)的病理表現(xiàn)。
細(xì)胞計(jì)數(shù)通常在細(xì)菌性腦膜炎中升高最明顯，在慢性或病毒感染中則呈中度升高。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)約1/3腫瘤細(xì)胞腦脊液播散的患者，其細(xì)胞計(jì)數(shù)并不明顯升高，因此無論細(xì)胞計(jì)數(shù)如何，都應(yīng)盡量進(jìn)行CSF細(xì)胞學(xué)檢查。另外肉眼可見的血液污染不可避免導(dǎo)致CSF白細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，鏡下以中性粒細(xì)胞為主的表現(xiàn)。在此情況下，為了估計(jì)真實(shí)的CSF細(xì)胞計(jì)數(shù)，每1,000-1,500個(gè)紅細(xì)胞中減去一個(gè)白細(xì)胞。腦室引流的腦脊液細(xì)胞計(jì)數(shù)通常與腰穿的結(jié)果無明顯差異。在實(shí)踐中，我們通過牛鮑氏計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量的同時(shí)，會(huì)對(duì)濕片中的有核細(xì)胞大小進(jìn)行初步評(píng)估，對(duì)于疑似有異常細(xì)胞時(shí)，我們會(huì)加制多張細(xì)胞片，以備進(jìn)行免疫組化染色。
離心方法和常規(guī)染色
對(duì)于細(xì)胞學(xué)診斷醫(yī)師而言，優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞學(xué)制片效果至關(guān)重要。在Sayk（1954年）和Watson（1966年）等相繼發(fā)明了＂玻片細(xì)胞沉淀法”和＂細(xì)胞玻片離心沉淀法”后，能收集到的腦脊液細(xì)胞達(dá)90%以上，該方法才有了飛速的發(fā)展，成為了一門新型學(xué)科——腦脊液細(xì)胞學(xué)。我國(guó)的腦脊液細(xì)胞學(xué)研究開始于20世紀(jì)60年代，侯熙德教授和粟秀初教授先后建立了腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查室，并研制成功了自然沉淀器和微型腦脊液細(xì)胞玻片離心沉淀儀。1986年孔繁元教授引進(jìn)玻片離心沉淀儀并國(guó)產(chǎn)化，后第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院又對(duì)原沉淀儀進(jìn)行了改進(jìn)，新一代細(xì)胞涂片離心沉淀儀已經(jīng)問世并投入使用，細(xì)胞回收率和完整率分別達(dá)80.5% 和99.9%。我們?cè)诖嘶A(chǔ)上改進(jìn)的腦脊液細(xì)胞收集器，進(jìn)一步提升了腦脊液細(xì)胞的收集效率和細(xì)胞形態(tài)的完整性。
取部分CSF并以600-700rpm離心，專用的吸水紙可吸去液體成分，而細(xì)胞則沉淀在顯微鏡載玻片上。常規(guī)的染色方案有：
麥-格倫沃爾德-姬姆薩（May-Grunwald-Giemsa，MGG）
MGG是評(píng)估細(xì)胞學(xué)特征的標(biāo)準(zhǔn)染色。它由伊紅、亞甲藍(lán)、甲醇和吉姆薩染料組成，細(xì)胞核通常比呈現(xiàn)紅色、藍(lán)色或紫色的細(xì)胞質(zhì)更暗。類似地，瑞氏（Wright)染色，主要染料也是伊紅和亞甲藍(lán)，該染色常用于血涂片和骨髓細(xì)胞學(xué)血檢查。另外與MGG相比，瑞氏染色的時(shí)間較短，但染色效果稍差一些。
革蘭氏染色（Gram）
革蘭氏染色可以更好地區(qū)分革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌。前者呈現(xiàn)藍(lán)色至紫色，后者呈現(xiàn)紅色。與其他染色相比，通常使用油鏡在未覆蓋的載玻片上，并在高放大倍數(shù)（400*，1000*）下檢查。需要注意的是，革蘭氏染色的敏感性低于CSF微生物培養(yǎng)。
抗酸染色（Ziehl-Neelsen）
抗酸染色適用于疑似結(jié)核性腦膜炎的情況。它將分枝桿菌呈現(xiàn)為明亮的紅色絲狀結(jié)構(gòu)，而在MGG或革蘭氏染色下顯示效果不佳。
其他染色
其他染色包括：1）印度墨汁染色，用于鑒定隱球菌（特征為周圍膠囊狀的小圓形、致密結(jié)構(gòu)）。2）普魯士藍(lán)染色，用于鑒定血紅蛋白降解后在巨噬細(xì)胞中沉積的含鐵血黃素。3）高碘酸 - 希夫（Periodic Acid–Schiff，PAS）染色，可有助于鑒定真菌。
免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記
在疑似腫瘤性腦膜炎的情況下，免疫細(xì)胞化學(xué)可用于檢測(cè)和進(jìn)一步表征腫瘤細(xì)胞。常用的抗體包括抗細(xì)胞角蛋白（anticytokeratin，CK）或上皮細(xì)胞膜抗原（epithelial membrane antigen，EMA），兩者均可證實(shí)上皮源性腫瘤細(xì)胞。同樣，淋巴細(xì)胞標(biāo)志物，CD3+(T淋巴細(xì)胞)、CD20+(B淋巴細(xì)胞)、MUM1、PAX5可作為B細(xì)胞腫瘤的鑒別抗體。我們?cè)谶x擇免疫組化抗體時(shí)需根據(jù)瑞氏下的細(xì)胞形態(tài)對(duì)疾病進(jìn)行初步判斷，并結(jié)合患者的綜合情況來選擇。腦脊液細(xì)胞免疫組化與病理科的組織免疫組化最大的不同是，病理組織可以切無限多的切片，而腦脊液的細(xì)胞片顯得更加的珍貴，每一個(gè)抗體的選擇都是基于對(duì)疾病的鑒別診斷。
腦脊液細(xì)胞學(xué)
以下章節(jié)將詳細(xì)敘述各種CSF細(xì)胞計(jì)數(shù)升高的不同情況下，細(xì)胞學(xué)的詳細(xì)形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。CSF細(xì)胞學(xué)檢查最好在專們的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，其中要有經(jīng)驗(yàn)豐富的、熟悉細(xì)胞學(xué)特征的檢驗(yàn)醫(yī)師。
圖1 粒細(xì)胞的表現(xiàn)特征：（A）正常腦脊液：可見淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。（B）細(xì)菌性腦膜炎，中性粒細(xì)胞為主，可見大量細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外細(xì)菌。（C）嗜酸性腦膜炎，具有特征性的雙核型嗜酸性粒細(xì)胞。（D）混合粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞表現(xiàn)。注意單個(gè)活化的淋巴細(xì)胞，擴(kuò)大的細(xì)胞質(zhì)、典型的核周間隙。
1.正常腦脊液：存在淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞（圖1A）。淋巴細(xì)胞通常呈圓形大小均一，細(xì)胞核染色質(zhì)密集，細(xì)胞質(zhì)狹窄、呈嗜堿性單核細(xì)胞比淋巴細(xì)胞更大，細(xì)胞核橢圓形、腎形，細(xì)胞質(zhì)呈更寬的灰色。偶可見中性粒細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞這些軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)豐富的嗜酸性細(xì)胞質(zhì)，較小的、染色質(zhì)密集的細(xì)胞核。
2.細(xì)菌性腦膜炎：沒有明顯血液污染的情況下，由中性粒細(xì)胞為主的細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)可找到細(xì)菌。細(xì)菌通?？勺冃巍⑿螤畈煌揖坏慕Y(jié)構(gòu)——球菌或桿菌，有時(shí)周圍可見暈環(huán)，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外均可見。值得注意的是，偶可見在單純二次污染的腦脊液樣本中，細(xì)胞外細(xì)菌的大量過度生長(zhǎng)。革蘭氏染色可進(jìn)一步區(qū)分革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌。例如，呈鏈狀排列的革蘭氏陽(yáng)性球菌提示肺炎鏈球菌，而革蘭氏陰性球菌提示腦膜炎奈瑟球菌。然而，革蘭氏染色經(jīng)常產(chǎn)生兩性染色結(jié)果，可能得到模棱兩可的解釋而降低了敏感性。因此微生物培養(yǎng)被認(rèn)為才是細(xì)菌檢查的金標(biāo)準(zhǔn)。而且CSF培養(yǎng)可同時(shí)進(jìn)行抗菌藥物測(cè)試，尤其有利于指導(dǎo)難治性腦膜炎的治療。對(duì)于免疫抑制患者，需要警惕去細(xì)胞細(xì)菌性腦膜炎（acellular bacterial meningitis），表現(xiàn)為大量的細(xì)菌、缺失的粒細(xì)胞正常反應(yīng)、正常的細(xì)胞計(jì)數(shù)。
3.中性粒細(xì)胞比例升高的其他疾?。翰还芗?xì)胞計(jì)數(shù)絕對(duì)數(shù)是否升高，中性粒細(xì)胞比例升高的情況，包括病毒感染的早期階段，對(duì)中風(fēng)、出血、癲癇發(fā)作或神經(jīng)外科手術(shù)的非特異性反應(yīng)。
4.嗜酸性粒細(xì)胞為特征的疾病：嗜酸性粒細(xì)胞具有典型的特征性雙核型，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)密集的、豐富的嗜酸性顆粒（圖1 C）。它們不存在于正常腦脊液中。嗜酸性粒細(xì)胞為主的特征表現(xiàn)，臨床診斷指向寄生蟲感染或異物反應(yīng)，例如永久性腦室引流。結(jié)核性或肉芽腫性腦膜炎以及霍奇金淋巴瘤，偶爾會(huì)出現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞。
5.混合細(xì)胞為特征：同時(shí)由粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞組成，盡管比例是可變的。它被認(rèn)為是非特異性的、在許多臨床條件下可見，包括炎性、反應(yīng)性條件（圖1D）。特殊染色如抗酸染色或PAS染色分別有助于鑒別結(jié)核性或真菌性藥物，盡管陰性結(jié)果不能排除這些疾病。微生物培養(yǎng)可增加診斷準(zhǔn)確性，而聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的分析越來越多地用于臨床，因?yàn)樗鼈兘橛诤臅r(shí)且昂貴的微生物培養(yǎng)和廉價(jià)但不準(zhǔn)確的革蘭氏染色之間。
6.淋巴細(xì)胞活化為特征：淋巴細(xì)胞活化導(dǎo)致顯著的細(xì)胞增大、具有灰暗的嗜堿性細(xì)胞質(zhì)和特征性核周間隙（圖2A）?；罨馨图?xì)胞可分化為成熟的漿細(xì)胞，后者呈現(xiàn)偏位的細(xì)胞核，及其獨(dú)特的粗染色質(zhì)結(jié)構(gòu)（圖2B）。偶爾可見雙核型（圖2C）。激活的淋巴細(xì)胞和成熟漿細(xì)胞之間的區(qū)別有時(shí)較困難，因?yàn)榉只闹虚g形式較常見并且反映了持續(xù)的細(xì)胞分化狀態(tài)。這兩種細(xì)胞類型可見于病毒或自身免疫相關(guān)的疾病，以及對(duì)非特異性腦膜刺激的反應(yīng)，包括化學(xué)或機(jī)械性傷害性刺激。在神經(jīng)疏松癥或皰疹病毒感染中，過度活化淋巴細(xì)胞可能會(huì)與惡性淋巴瘤細(xì)胞較難鑒別（圖2D）。惡性淋巴組織增生性疾病的特征是均一的單克隆細(xì)胞群，但更廣泛的、大小可變的淋巴細(xì)胞以 及成熟的漿細(xì)胞則支持炎癥感染診斷。另外髓內(nèi)多克隆免疫球蛋白的檢測(cè)可用于惡性腫瘤的進(jìn)一步鑒別診斷。免疫細(xì)胞化學(xué)和/或熒光激活細(xì)胞分類、細(xì)胞群的詳細(xì)免疫表型分析是評(píng)估細(xì)胞單克隆性的進(jìn)一步有用工具。
圖2 淋巴細(xì)胞的各種表現(xiàn)特征：（A）從小到大的各異淋巴細(xì)胞表現(xiàn)。（B）具有特征性粗染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞質(zhì)偏位的漿細(xì)胞。（C）偶見雙核的漿細(xì)胞（箭頭所示）。（D）顯著活化，包括類淋巴瘤細(xì)胞的大淋巴細(xì)胞以及有絲分裂像的淋巴細(xì)胞（箭頭）。
7.蛛網(wǎng)膜下腔出血與新鮮血液污染的鑒別診斷：不同于新鮮血液污染（圖3 A），噬紅細(xì)胞、噬鐵細(xì)胞的存在，傾向于先前的蛛網(wǎng)膜下腔出血診斷（圖3 B和C）。兩種細(xì)胞類型均為巨噬細(xì)胞，即由空泡化的活化單核細(xì)胞來源，吞噬了紅細(xì)胞、血紅蛋白降解后產(chǎn)生的藍(lán)色、含鐵血血黃素。值得注意的是，反復(fù)腰椎穿刺時(shí)可能也會(huì)遇到孤立的噬鐵細(xì)胞，是由腰穿穿刺產(chǎn)生的。膽紅素結(jié)晶是由膽紅素累積引起的，小的、黃色至橙色晶體，見于細(xì)胞外或噬鐵細(xì)胞內(nèi)（圖3D）。
圖3 出血性疾病特征：（A）新鮮血液污染，密集的紅細(xì)胞、偶見中性粒細(xì)胞。（B）噬紅細(xì)胞，成蔟的，大量空泡化的細(xì)胞質(zhì)中，可見吞噬的紅細(xì)胞殘片。（C）噬鐵細(xì)胞，藍(lán)色、含鐵血紅素顆粒的、泡沫狀細(xì)胞質(zhì)。（D）膽紅素結(jié)晶，紅細(xì)胞包繞、黃色、膽紅素結(jié)晶（箭頭所示）。
8.腫瘤性腦膜炎的表現(xiàn)：腫瘤細(xì)胞通常表現(xiàn)為大細(xì)胞的，不規(guī)則形狀的、染色質(zhì)豐富的細(xì)胞核，可見明顯核仁，和暗色的嗜堿性細(xì)胞質(zhì)（圖4 A）。核質(zhì)比通常較高。腺癌細(xì)胞通常細(xì)胞質(zhì)可見較大的空泡，為存儲(chǔ)粘蛋白的囊泡。有時(shí)因囊泡較大使得細(xì)胞核偏位（稱印戒細(xì)胞）。有些癌細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則的細(xì)胞質(zhì)突起和偽足（圖4 C）。同樣，多發(fā)性有絲分裂象也支持腫瘤源性細(xì)胞，而正?；蜓仔苑磻?yīng)細(xì)胞中偶見單個(gè)有絲分裂（圖4 C）。密集的、相對(duì)單一形狀的細(xì)胞群提示淋巴瘤（圖4 D）。免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記（如上皮來源的癌細(xì)胞的角蛋白標(biāo)記、血液學(xué)標(biāo)記等）可進(jìn)一步精確的亞型分析（圖4 B，D和F）。
國(guó)內(nèi)腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查目前存在的主要問題有：1.部分臨床醫(yī)生對(duì)腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查的重要性認(rèn)識(shí)不足，2.缺乏標(biāo)準(zhǔn)制片流程（由于腦脊液細(xì)胞數(shù)較低，普通制片流程往往檢出率很低，標(biāo)準(zhǔn)制片流程對(duì)提高檢出率至關(guān)重要），3.從事細(xì)胞學(xué)檢查的有經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)或病理醫(yī)師嚴(yán)重不足。然而以下情況還是有必要進(jìn)行腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查：1）腦脊液細(xì)胞計(jì)數(shù)增多；2）CT陰性的疑似蛛網(wǎng)膜下腔出血；3）排查腫瘤性腦膜炎；4）MRI提示腦膜強(qiáng)化。腦脊液細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查作為快速、有效及低成本的方法，已經(jīng)成為我院的特色檢查項(xiàng)目，是神經(jīng)系統(tǒng)疾病的篩查與診斷工具。在這里，我們提供了一份從腦脊液樣本處理到CSF細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞學(xué)分類、細(xì)胞學(xué)診斷的實(shí)踐總結(jié)給廣大同仁參考交流。為了解腦脊液檢查現(xiàn)狀，文末我們還提供了一份腦脊液檢查現(xiàn)狀的小調(diào)查，懇請(qǐng)各位同仁撥冗填寫，并歡迎多提寶貴建議！
概述
腦脊液（CerebroSpinal Fluid, CSF）細(xì)胞學(xué)，是神經(jīng)病學(xué)家的最重要工具之一，包含總體細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞學(xué)分類，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)及其涵蓋的一系列病理狀況提供重要的第一手信息。CSF樣本需要立即處理，盡可能在收集后1小時(shí)內(nèi)處理。離心制片后，我們實(shí)驗(yàn)室通常采用瑞氏染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查。對(duì)于細(xì)胞背景提示有感染存在時(shí)，我們會(huì)加做抗酸染色、革蘭染色等，并尋找相關(guān)病原體。發(fā)現(xiàn)異形細(xì)胞時(shí)，我們常通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色來進(jìn)一步確定并鑒定腫瘤細(xì)胞。在正常CSF細(xì)胞以T淋巴細(xì)胞為主，少量單核巨噬細(xì)胞，偶見B淋巴細(xì)胞。細(xì)胞數(shù)明顯增加，鏡下以中性粒細(xì)胞為主時(shí)多見于細(xì)菌性腦膜炎，需進(jìn)一步尋找胞內(nèi)細(xì)菌證據(jù)。以淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞為主的細(xì)胞背景多見于病毒感染和慢性炎癥。以混雜細(xì)胞反應(yīng)為背景時(shí)，可發(fā)生于結(jié)核性腦膜炎。吞噬紅細(xì)胞或含血紅蛋白降解產(chǎn)物片段的巨噬細(xì)胞（后者稱為含鐵血黃素細(xì)胞），均提示陳舊性的蛛網(wǎng)膜下腔出血。鏡下發(fā)現(xiàn)異型細(xì)胞懷疑腫瘤時(shí)，需結(jié)合臨床及免疫細(xì)胞化學(xué)染色綜合判斷。
處理時(shí)間
由于腦脊液樣本在體外2小時(shí)后細(xì)胞快速裂解。與腦脊液生化分析不同，CSF細(xì)胞學(xué)和細(xì)胞計(jì)數(shù)檢查需要立即處理新鮮液體，最好在腰椎穿刺后1小時(shí)內(nèi)。按照我們實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)，腦脊液采集后在4攝氏度下保存條件下存放4小時(shí)，細(xì)胞形態(tài)基本可保持完整。
外觀檢查
新鮮CSF的肉眼檢查可提供重要的第一手信息，應(yīng)作為CSF檢驗(yàn)報(bào)告的一部分。正常腦脊液清澈無色。如果白細(xì)胞計(jì)數(shù)高于1,000/μL，腦脊液顏色可呈現(xiàn)混濁和不透明。化膿性炎癥通常呈現(xiàn)出濃稠和黃色至綠色。明顯呈現(xiàn)的紅色提示腦脊液樣本可能發(fā)生了血液污染。連續(xù)數(shù)管的樣本收集，可以幫助區(qū)分腰穿刺術(shù)本身相關(guān)的創(chuàng)傷性血液污染或真正的蛛網(wǎng)膜下腔出血：如果連續(xù)的CSF樣本逐漸變清提示可能是進(jìn)針時(shí)傷及血管所致，而持續(xù)性變色則表明真正的蛛網(wǎng)膜下腔出血。黃變癥（Xanthochromia）即黃色變色，在離心后持續(xù)存在，它是由膽紅素水平升高引起的。值得注意的是，創(chuàng)傷性血液污染可導(dǎo)致CSF細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，CSF混入外周血時(shí)，CSF細(xì)胞學(xué)可出現(xiàn)明顯的偏差。我們?cè)龅竭^腰椎穿刺被骨髓細(xì)胞污染的腦脊液標(biāo)本。因此腦脊液細(xì)胞學(xué)標(biāo)本最好是穿刺后的第二管沒有血液混入的樣本。
細(xì)胞計(jì)數(shù)
使用牛鮑氏（Neubauer）計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。正常細(xì)胞計(jì)數(shù)范圍為白細(xì)胞每微升0至4個(gè)（mm^3）。高于5/μL 的細(xì)胞計(jì)數(shù)被稱為白細(xì)胞異常升高或細(xì)胞增多癥。未成熟的血腦屏障細(xì)胞滲透性較高，在足月新生兒腦脊液中常見細(xì)胞數(shù)高達(dá)10/ μL。在早產(chǎn)兒中水平甚至可以達(dá)到30 / μL。然而，在產(chǎn)后第六周，細(xì)胞計(jì)數(shù)逐漸下降并且任何持續(xù)升高的細(xì)胞計(jì)數(shù)被認(rèn)為病理性升高。按升高的程度可分為輕度（5-50/ μL），中度（50-150 / μL）或嚴(yán)重（150-3,000 / μL）。下表總結(jié)了典型的細(xì)胞計(jì)數(shù)及其相關(guān)的病理表現(xiàn)。
細(xì)胞計(jì)數(shù)通常在細(xì)菌性腦膜炎中升高最明顯，在慢性或病毒感染中則呈中度升高。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)約1/3腫瘤細(xì)胞腦脊液播散的患者，其細(xì)胞計(jì)數(shù)并不明顯升高，因此無論細(xì)胞計(jì)數(shù)如何，都應(yīng)盡量進(jìn)行CSF細(xì)胞學(xué)檢查。另外肉眼可見的血液污染不可避免導(dǎo)致CSF白細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，鏡下以中性粒細(xì)胞為主的表現(xiàn)。在此情況下，為了估計(jì)真實(shí)的CSF細(xì)胞計(jì)數(shù)，每1,000-1,500個(gè)紅細(xì)胞中減去一個(gè)白細(xì)胞。腦室引流的腦脊液細(xì)胞計(jì)數(shù)通常與腰穿的結(jié)果無明顯差異。在實(shí)踐中，我們通過牛鮑氏計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量的同時(shí)，會(huì)對(duì)濕片中的有核細(xì)胞大小進(jìn)行初步評(píng)估，對(duì)于疑似有異常細(xì)胞時(shí)，我們會(huì)加制多張細(xì)胞片，以備進(jìn)行免疫組化染色。
離心方法和常規(guī)染色
對(duì)于細(xì)胞學(xué)診斷醫(yī)師而言，優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞學(xué)制片效果至關(guān)重要。在Sayk（1954年）和Watson（1966年）等相繼發(fā)明了＂玻片細(xì)胞沉淀法”和＂細(xì)胞玻片離心沉淀法”后，能收集到的腦脊液細(xì)胞達(dá)90%以上，該方法才有了飛速的發(fā)展，成為了一門新型學(xué)科——腦脊液細(xì)胞學(xué)。我國(guó)的腦脊液細(xì)胞學(xué)研究開始于20世紀(jì)60年代，侯熙德教授和粟秀初教授先后建立了腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查室，并研制成功了侯氏自然沉淀器和粟氏FMU-5微型腦脊液細(xì)胞玻片離心沉淀儀。1986年孔繁元教授引進(jìn)Cytospin-2 玻片離心沉淀儀并國(guó)產(chǎn)化，后第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院又對(duì)原粟氏沉淀儀進(jìn)行了改進(jìn)，新一代FMU-6細(xì)胞涂片離心沉淀儀已經(jīng)問世并投入使用，細(xì)胞回收率和完整率分別達(dá)80.5% 和99.9%。我們?cè)诖嘶A(chǔ)上改進(jìn)的腦脊液細(xì)胞收集器，進(jìn)一步提升了腦脊液細(xì)胞的收集效率和細(xì)胞形態(tài)的完整性。
取部分CSF并以600-700rpm離心，專用的吸水紙可吸去液體成分，而細(xì)胞則沉淀在顯微鏡載玻片上。常規(guī)的染色方案有：
麥-格倫沃爾德-姬姆薩（May-Grunwald-Giemsa，MGG）
MGG是評(píng)估細(xì)胞學(xué)特征的標(biāo)準(zhǔn)染色。它由伊紅、亞甲藍(lán)、甲醇和吉姆薩染料組成，細(xì)胞核通常比呈現(xiàn)紅色、藍(lán)色或紫色的細(xì)胞質(zhì)更暗。類似地，瑞氏（Wright)染色，主要染料也是伊紅和亞甲藍(lán)，該染色常用于血涂片和骨髓細(xì)胞學(xué)血檢查。另外與MGG相比，瑞氏染色的時(shí)間較短，但染色效果稍差一些。
革蘭氏染色（Gram）
革蘭氏染色可以更好地區(qū)分革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌。前者呈現(xiàn)藍(lán)色至紫色，后者呈現(xiàn)紅色。與其他染色相比，通常使用油鏡在未覆蓋的載玻片上，并在高放大倍數(shù)（400*，1000*）下檢查。需要注意的是，革蘭氏染色的敏感性低于CSF微生物培養(yǎng)。
抗酸染色（Ziehl-Neelsen）
抗酸染色適用于疑似結(jié)核性腦膜炎的情況。它將分枝桿菌呈現(xiàn)為明亮的紅色絲狀結(jié)構(gòu)，而在MGG或革蘭氏染色下顯示效果不佳。
其他染色
其他染色包括：1）印度墨汁染色，用于鑒定隱球菌（特征為周圍膠囊狀的小圓形、致密結(jié)構(gòu)）。2）普魯士藍(lán)染色，用于鑒定血紅蛋白降解后在巨噬細(xì)胞中沉積的含鐵血黃素。3）高碘酸 - 希夫（Periodic Acid–Schiff，PAS）染色，可有助于鑒定真菌。
免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記
在疑似腫瘤性腦膜炎的情況下，免疫細(xì)胞化學(xué)可用于檢測(cè)和進(jìn)一步表征腫瘤細(xì)胞。常用的抗體包括抗細(xì)胞角蛋白（anticytokeratin，CK）或上皮細(xì)胞膜抗原（epithelial membrane antigen，EMA），兩者均可證實(shí)上皮源性腫瘤細(xì)胞。同樣，淋巴細(xì)胞標(biāo)志物，CD3+(T淋巴細(xì)胞)、CD20+(B淋巴細(xì)胞)、MUM1、PAX5可作為B細(xì)胞腫瘤的鑒別抗體。我們?cè)谶x擇免疫組化抗體時(shí)需根據(jù)瑞氏下的細(xì)胞形態(tài)對(duì)疾病進(jìn)行初步判斷，并結(jié)合患者的綜合情況來選擇。腦脊液細(xì)胞免疫組化與病理科的組織免疫組化最大的不同是，病理組織可以切無限多的切片，而腦脊液的細(xì)胞片顯得更加的珍貴，每一個(gè)抗體的選擇都是基于對(duì)疾病的鑒別診斷。
腦脊液細(xì)胞學(xué)
以下章節(jié)將詳細(xì)敘述各種CSF細(xì)胞計(jì)數(shù)升高的不同情況下，細(xì)胞學(xué)的詳細(xì)形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。CSF細(xì)胞學(xué)檢查最好在專們的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，其中要有經(jīng)驗(yàn)豐富的、熟悉細(xì)胞學(xué)特征的檢驗(yàn)醫(yī)師。
圖1 粒細(xì)胞的表現(xiàn)特征：（A）正常腦脊液：可見淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。（B）細(xì)菌性腦膜炎，中性粒細(xì)胞為主，可見大量細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外細(xì)菌。（C）嗜酸性腦膜炎，具有特征性的雙核型嗜酸性粒細(xì)胞。（D）混合粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞表現(xiàn)。注意單個(gè)活化的淋巴細(xì)胞，擴(kuò)大的細(xì)胞質(zhì)、典型的核周間隙。
1.正常腦脊液：存在淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞（圖1A）。淋巴細(xì)胞通常呈圓形大小均一，細(xì)胞核染色質(zhì)密集，細(xì)胞質(zhì)狹窄、呈嗜堿性單核細(xì)胞比淋巴細(xì)胞更大，細(xì)胞核橢圓形、腎形，細(xì)胞質(zhì)呈更寬的灰色。偶可見中性粒細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞這些軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)豐富的嗜酸性細(xì)胞質(zhì)，較小的、染色質(zhì)密集的細(xì)胞核。
2.細(xì)菌性腦膜炎：沒有明顯血液污染的情況下，由中性粒細(xì)胞為主的細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)可找到細(xì)菌。細(xì)菌通常可變形、形狀不同且均一的結(jié)構(gòu)——球菌或桿菌，有時(shí)周圍可見暈環(huán)，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外均可見。值得注意的是，偶可見在單純二次污染的腦脊液樣本中，細(xì)胞外細(xì)菌的大量過度生長(zhǎng)。革蘭氏染色可進(jìn)一步區(qū)分革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌。例如，呈鏈狀排列的革蘭氏陽(yáng)性球菌提示肺炎鏈球菌，而革蘭氏陰性球菌提示腦膜炎奈瑟球菌。然而，革蘭氏染色經(jīng)常產(chǎn)生兩性染色結(jié)果，可能得到模棱兩可的解釋而降低了敏感性。因此微生物培養(yǎng)被認(rèn)為才是細(xì)菌檢查的金標(biāo)準(zhǔn)。而且CSF培養(yǎng)可同時(shí)進(jìn)行抗菌藥物測(cè)試，尤其有利于指導(dǎo)難治性腦膜炎的治療。對(duì)于免疫抑制患者，需要警惕去細(xì)胞細(xì)菌性腦膜炎（acellular bacterial meningitis），表現(xiàn)為大量的細(xì)菌、缺失的粒細(xì)胞正常反應(yīng)、正常的細(xì)胞計(jì)數(shù)。
3.中性粒細(xì)胞比例升高的其他疾病：不管細(xì)胞計(jì)數(shù)絕對(duì)數(shù)是否升高，中性粒細(xì)胞比例升高的情況，包括病毒感染的早期階段，對(duì)中風(fēng)、出血、癲癇發(fā)作或神經(jīng)外科手術(shù)的非特異性反應(yīng)。
4.嗜酸性粒細(xì)胞為特征的疾?。菏人嵝粤＜?xì)胞具有典型的特征性雙核型，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)密集的、豐富的嗜酸性顆粒（圖1 C）。它們不存在于正常腦脊液中。嗜酸性粒細(xì)胞為主的特征表現(xiàn)，臨床診斷指向寄生蟲感染或異物反應(yīng)，例如永久性腦室引流。結(jié)核性或肉芽腫性腦膜炎以及霍奇金淋巴瘤，偶爾會(huì)出現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞。
5.混合細(xì)胞為特征：同時(shí)由粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞組成，盡管比例是可變的。它被認(rèn)為是非特異性的、在許多臨床條件下可見，包括炎性、反應(yīng)性條件（圖1D）。特殊染色如抗酸染色或PAS染色分別有助于鑒別結(jié)核性或真菌性藥物，盡管陰性結(jié)果不能排除這些疾病。微生物培養(yǎng)可增加診斷準(zhǔn)確性，而聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的分析越來越多地用于臨床，因?yàn)樗鼈兘橛诤臅r(shí)且昂貴的微生物培養(yǎng)和廉價(jià)但不準(zhǔn)確的革蘭氏染色之間。
6.淋巴細(xì)胞活化為特征：淋巴細(xì)胞活化導(dǎo)致顯著的細(xì)胞增大、具有灰暗的嗜堿性細(xì)胞質(zhì)和特征性核周間隙（圖2A）。活化淋巴細(xì)胞可分化為成熟的漿細(xì)胞，后者呈現(xiàn)偏位的細(xì)胞核，及其獨(dú)特的粗染色質(zhì)結(jié)構(gòu)（圖2B）。偶爾可見雙核型（圖2C）。激活的淋巴細(xì)胞和成熟漿細(xì)胞之間的區(qū)別有時(shí)較困難，因?yàn)榉只闹虚g形式較常見并且反映了持續(xù)的細(xì)胞分化狀態(tài)。這兩種細(xì)胞類型可見于病毒或自身免疫相關(guān)的疾病，以及對(duì)非特異性腦膜刺激的反應(yīng)，包括化學(xué)或機(jī)械性傷害性刺激。在神經(jīng)疏松癥或皰疹病毒感染中，過度活化淋巴細(xì)胞可能會(huì)與惡性淋巴瘤細(xì)胞較難鑒別（圖2D）。惡性淋巴組織增生性疾病的特征是均一的單克隆細(xì)胞群，但更廣泛的、大小可變的淋巴細(xì)胞以 及成熟的漿細(xì)胞則支持炎癥感染診斷。另外髓內(nèi)多克隆免疫球蛋白的檢測(cè)可用于惡性腫瘤的進(jìn)一步鑒別診斷。免疫細(xì)胞化學(xué)和/或熒光激活細(xì)胞分類、細(xì)胞群的詳細(xì)免疫表型分析是評(píng)估細(xì)胞單克隆性的進(jìn)一步有用工具。
圖2 淋巴細(xì)胞的各種表現(xiàn)特征：（A）從小到大的各異淋巴細(xì)胞表現(xiàn)。（B）具有特征性粗染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞質(zhì)偏位的漿細(xì)胞。（C）偶見雙核的漿細(xì)胞（箭頭所示）。（D）顯著活化，包括類淋巴瘤細(xì)胞的大淋巴細(xì)胞以及有絲分裂像的淋巴細(xì)胞（箭頭）。
7.蛛網(wǎng)膜下腔出血與新鮮血液污染的鑒別診斷：不同于新鮮血液污染（圖3 A），噬紅細(xì)胞、噬鐵細(xì)胞的存在，傾向于先前的蛛網(wǎng)膜下腔出血診斷（圖3 B和C）。兩種細(xì)胞類型均為巨噬細(xì)胞，即由空泡化的活化單核細(xì)胞來源，吞噬了紅細(xì)胞、血紅蛋白降解后產(chǎn)生的藍(lán)色、含鐵血血黃素。值得注意的是，反復(fù)腰椎穿刺時(shí)可能也會(huì)遇到孤立的噬鐵細(xì)胞，是由腰穿穿刺產(chǎn)生的。膽紅素結(jié)晶是由膽紅素累積引起的，小的、黃色至橙色晶體，見于細(xì)胞外或噬鐵細(xì)胞內(nèi)（圖3D）。
圖3 出血性疾病特征：（A）新鮮血液污染，密集的紅細(xì)胞、偶見中性粒細(xì)胞。（B）噬紅細(xì)胞，成蔟的，大量空泡化的細(xì)胞質(zhì)中，可見吞噬的紅細(xì)胞殘片。（C）噬鐵細(xì)胞，藍(lán)色、含鐵血紅素顆粒的、泡沫狀細(xì)胞質(zhì)。（D）膽紅素結(jié)晶，紅細(xì)胞包繞、黃色、膽紅素結(jié)晶（箭頭所示）。
8.腫瘤性腦膜炎的表現(xiàn)：腫瘤細(xì)胞通常表現(xiàn)為大細(xì)胞的，不規(guī)則形狀的、染色質(zhì)豐富的細(xì)胞核，可見明顯核仁，和暗色的嗜堿性細(xì)胞質(zhì)（圖4 A）。核質(zhì)比通常較高。腺癌細(xì)胞通常細(xì)胞質(zhì)可見較大的空泡，為存儲(chǔ)粘蛋白的囊泡。有時(shí)因囊泡較大使得細(xì)胞核偏位（稱印戒細(xì)胞）。有些癌細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則的細(xì)胞質(zhì)突起和偽足（圖4 C）。同樣，多發(fā)性有絲分裂象也支持腫瘤源性細(xì)胞，而正常或炎性反應(yīng)細(xì)胞中偶見單個(gè)有絲分裂（圖4 C）。密集的、相對(duì)單一形狀的細(xì)胞群提示淋巴瘤（圖4 D）。免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記（如上皮來源的癌細(xì)胞的角蛋白標(biāo)記、血液學(xué)標(biāo)記等）可進(jìn)一步精確的亞型分析（圖4 B，D和F）。
圖4 腫瘤性腦膜炎的表現(xiàn)特征：（A）多形性腫瘤細(xì)胞簇，在乳腺癌患者中偶爾有粘液性細(xì)胞質(zhì)囊泡。（B）細(xì)胞角蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)了上皮來源。（C）多個(gè)腫瘤細(xì)胞在患有肺癌的患者中顯示出不規(guī)則的細(xì)胞質(zhì)突起。注意兩個(gè)有絲分裂的數(shù)字。（D）上皮細(xì)胞膜抗原的免疫細(xì)胞化學(xué)顯示出強(qiáng)烈的膜質(zhì)和彌散性細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記。（F）免疫化學(xué)證實(shí)抗-CD20陽(yáng)性，（E）彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中密集的單一形態(tài)細(xì)胞。
參考文獻(xiàn)
Rahimi, Jasmin, and Adelheid Woehrer. "Overview of cerebrospinal fluid cytology." Handbook of clinical neurology. Vol. 145. Elsevier, 2018. 563-571.
圖4 腫瘤性腦膜炎的表現(xiàn)特征：（A）多形性腫瘤細(xì)胞簇，在乳腺癌患者中偶爾有粘液性細(xì)胞質(zhì)囊泡。（B）細(xì)胞角蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)了上皮來源。（C）多個(gè)腫瘤細(xì)胞在患有肺癌的患者中顯示出不規(guī)則的細(xì)胞質(zhì)突起。注意兩個(gè)有絲分裂的數(shù)字。（D）上皮細(xì)胞膜抗原的免疫細(xì)胞化學(xué)顯示出強(qiáng)烈的膜質(zhì)和彌散性細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記。（F）免疫化學(xué)證實(shí)抗-CD20陽(yáng)性，（E）彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中密集的單一形態(tài)細(xì)胞。
參考文獻(xiàn)
Rahimi, Jasmin, and Adelheid Woehrer. "Overview of cerebrospinal fluid cytology." Handbook of clinical neurology. Vol. 145. Elsevier, 2018. 563-571.
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