PCR實(shí)驗(yàn)分區(qū)少不了掌上離心機(jī)
掌上離心機(jī)也可以稱為迷你離心機(jī),用于微量實(shí)驗(yàn)。
常見(jiàn)得應(yīng)用有:
1、全血中提取血清。
2、各種樣品提取上清液。
3、樣品快速沉降。
4、微量血細(xì)胞分離。
5、微生物樣品處理。
6、PCR實(shí)驗(yàn)分區(qū)離心。
以最后一個(gè)實(shí)驗(yàn)為例,
了解PCR實(shí)驗(yàn)分區(qū)就要先了解氣溶膠,氣溶膠是由固體或液體小質(zhì)點(diǎn)分散并懸浮在氣體介質(zhì)中形成的膠體分散體系,在氣體與液體面摩擦?xí)r,操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管,離心機(jī)離心,擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物開(kāi)蓋時(shí)、吸樣時(shí)及移液器槍反復(fù)吹吸樣品時(shí)都可形成氣溶膠而污染。
綜上所述,為了得到好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,PCR反應(yīng)需要進(jìn)行嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)分區(qū):
常規(guī)需要設(shè)置3個(gè)獨(dú)立的分區(qū):試劑耗材儲(chǔ)存與準(zhǔn)備區(qū)、樣品處理和樣品制備區(qū),擴(kuò)增檢測(cè)區(qū),各區(qū)域空間完全獨(dú)立;實(shí)驗(yàn)室實(shí)施空氣流向控制,擴(kuò)增前和擴(kuò)增后區(qū)域應(yīng)具有獨(dú)立的通風(fēng)系統(tǒng),擴(kuò)增后區(qū)域保持負(fù)壓狀態(tài),其他區(qū)域保持常壓,防止擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)入擴(kuò)增前的區(qū)域。
PCR實(shí)驗(yàn)防止污染的方法:
(一)合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行,特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng) 與其它步驟嚴(yán)格分開(kāi)。zui好能劃分①標(biāo)本處理區(qū);②PCR反應(yīng)液制備區(qū);③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū);④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用,實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí) 驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。
(二)吸樣槍:吸樣槍污染是一個(gè)值得注意的問(wèn)題。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源,因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心,吸樣要慢,吸樣時(shí)盡量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。
(三)預(yù)混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝,如有可能,PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好,然后小量分裝,-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù),避免污染機(jī)會(huì)。另外,PCR試劑,PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開(kāi)保存,不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。
(四)防止操作人員污染,使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。
(五)設(shè)立適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照,陽(yáng)性對(duì)照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的zui低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜,并注意交叉污染的可能性,每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對(duì)照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對(duì)照。
(六)減少PCR循環(huán)次數(shù),只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測(cè)水平就適可而止。
(七)選擇質(zhì)量好的離心機(jī)管,以避免樣本外溢及外來(lái)核酸的進(jìn)入,打開(kāi)離心管前應(yīng)先離心,將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開(kāi)管動(dòng)作要輕,以防管內(nèi)液體濺出。
PCR實(shí)驗(yàn)分區(qū)儀器設(shè)備主要有冰箱、超凈臺(tái)、加樣器、混勻器、天平和掌上離心機(jī)等,加樣器、天平除了要專用外,還應(yīng)有定期校準(zhǔn)。 試劑分裝應(yīng)在超凈臺(tái)中進(jìn)行 擴(kuò)增反應(yīng)混合液應(yīng)使用分子生物學(xué)級(jí)的,試劑制備好后應(yīng)有質(zhì)檢:一是否有污染、二是檢測(cè)試劑的擴(kuò)增效果。
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