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血清脂蛋白的離心機分離技術(shù)

發(fā)布時間:2014-3-4 15:12:33??????點擊:

血清脂蛋白是由血液中脂質(zhì)與某些特異的蛋白質(zhì)組成的一類不均一的復合物。

因其所含脂與載脂蛋白的比例不同,其密度范圍在0.96g/ml或更低至1.21g/ml之間。

紙電泳中顯示四條帶即:乳密顆粒,極低密度脂蛋白,低密度脂蛋白,高密度脂蛋白。每種脂蛋白還可以分為更多的亞組分。

用電泳法分離含載脂蛋白較高的組份(HDL,VHDL)比較成功,而離心分離法則適合用于各種密度的血清脂蛋白分離。

 

一、梯度材料:

血清脂蛋白密度較低,常用的梯度材料為Nacl,NaI,Kbr,KI等,常用的緩沖劑為ED。
 
表一 常用梯度材料的配置及密度(20°C)
  名稱 配置 密度(g/ml)
  Nacl 0.196M 1.006
  NaBr 0.804M 1.063
  NaBr 2.705M 1.21
  KBr 0.747M 1.063
  KBr 1.496M 1.21
  NaCl+KBr+EDTA 153gNaCl+354gKBr+10ml
  0. 2MEDTA+水至總量1000ml  1.35
  NaCl,NaBr
  A液:200gNaCl+800ml水
  B 液:400gNaBr+600ml水
  C液11.14gNaCl+788.6ml水(ρ=1.006gml) 10ml A液+31.7mlB液
  10ml A液+15.6mlB液
  10ml C液+2ml 1.35液
  4ml C液+6ml 1.35液 1.35
  1.31
  1.063
  1.21

二、預分離:

1、血細胞與血清分離:
  離心參數(shù):全血,角轉(zhuǎn)頭,3,000rpm×20min
  結(jié)果:沉淀為血細胞,上部為血清。

2、乳糜粒分離:禁食12小時以上人血漿中乳糜粒含量極少,已進食者因其血漿含乳糜粒高,應先離心去除乳糜粒。
  離心參數(shù):4 ×10 (g×min),10°C.各種轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速均可。
  梯度液配置:離心管下部3/4容積加血漿,上部1/4容積加0。
  5MnaCl+0.3MEDTA,ph7.4
  結(jié)果:乳糜粒上浮,吸出。

3、血清蛋白分離:除去球蛋白,白蛋白及其它蛋白質(zhì)。
  離心參數(shù):(2。5-3)×10 (g× hr), 各種轉(zhuǎn)頭均可。如角轉(zhuǎn)頭70,000rpm× 6hrs,10°C
  配置:管容量1/3為血清,2/3為1。31g/ml,NaCl+NaBr,攪拌后終密度為1。21g/ml
  結(jié)果:管上部1/6容積為血清脂蛋白,下部5/6為其它蛋白。

 

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